Automatización y simplificación de las etapas de preparación de muestra para la determinación de sustancias farmacológicamente activas en matrices ambientales, alimentarias y biológicas

Abstract

Se ha planteado como objetivo principal la simplificación y automatización de las etapas previas de preparación de muestras para la determinación simultánea de diferentes tipos de sustancias farmacológicamente activas (antibióticos, antiinflamatorios no esteroideos/analgésicos, β-bloqueadores, reguladores de lípidos, hormonas, antiepilépticos, antidepresivos y antisépticos) en muestras ambientales, alimentos y fluidos biológicos. Se ha puesto a punto un sistema continuo para la extracción en fase sólida basado en el uso de una columna empaquetada con 60 mg del sorbente Oasis HLB con objeto de eliminar las interferencias de la matriz de la muestra y aumentar la sensibilidad a través de la preconcentración de los analitos de interés. En el caso de matrices complejas, tales como alimentos, suelos y fluidos biológicos, se han simplificado las etapas de pretratamiento de muestra con objeto de eliminar los componentes de éstas que pueden perturbar a las etapas de extracción en fase sólida, separación cromatográfica o ionización en el detector de espectrometría de masas de los analitos de interés. Esta etapa se ha llevado a cabo mediante la adición de un disolvente adecuado (acetonitrilo o metanol) y centrifugación o extracción en un horno de microondas convencional. También se ha minimizado el consumo de reactivos usados en la etapa de derivatización por sililación de las sustancias farmacológicamente activas, reduciéndose notablemente el tiempo requerido en la reacción cuando se llevaba a cabo en un horno de microondas. Las diferentes metodologías desarrolladas han permitido la determinación de hasta 22 sustancias farmacológicamente activas (ácido acetilsalicílico, ácido clofíbrico, ácido mefenámico, ácido niflúmico, carbamazepina, cloranfenicol, diclofenaco, estrona, 17β-estradiol, 17α-etinilestradiol, fenilbutazona, florfenicol, flunixino, ibuprofeno, ketoprofeno, metoprolol, naproxeno, paracetamol, propranolol, pirimetamina, tiamfenicol y triclosán) en diferentes tipos de muestras con la suficiente sensibilidad para la cuantificación de estas sustancias a niveles inferiores de ng/l con una buena precisión (desviación estándar relativa inferior a 7 %) y exactitud (recuperaciones próximas al 100 %). Es importante resaltar la gran variedad de muestras que han sido analizadas mediante los métodos desarrollados en esta Memoria. En la mayoría de las muestras ambientales (aguas, suelos, sedimentos y lodos), alimentos (leche, carne y pescado) y

fluidos biológicos (sangre y orina) se ha encontrado la presencia de algunos antiinflamatorios no esteroideos/ analgésicos, antibióticos, hormonas y productos de cuidado personalThe main goal of this doctoral work was to simplify and automate the preliminary sample preparation stages required for the simultaneous determination of various types of pharmacologically active substances including antibiotics, non-steroidal anti- inflammatories/analgesics, β-blockers, lipid regulators, hormones, anti-epileptics, antidepressants and antiseptics in environmental, food and biological matrices. To this end, a continuous solid-phase extraction system based on a column packed with 60 mg of Oasis HLB sorbent was used to preconcentrate the target analytes by extraction without interference from the sample matrix in order to increase the sensitivity of the determination method. The pretreatment steps for complex samples such as foods, soils and biological fluids were simplified in order to remove any components potentially interfering with the solid-phase extraction, chromatographic separation or mass spectrometry ionization detection of the target analytes. This was accomplished by using an appropriate solvent (acetonitrile or methanol) and centrifugation or extraction in a conventional microwave oven. Also, reagent consumption in the derivatization of pharmacologically active substances by silylation was minimized and the process expedited by conducting the reactions in the oven. The analytical methods used allowed the determination of up to 22 pharmacologically active substances including acetylsalicylic acid, clofibric acid, mefenamic acid, niflumic acid, carbamazepine, cloramphenicol, diclofenac, estrone, 17β-estradiol, 17α-ethinylestradiol, phenylbutazone, florfenicol, flunixin, ibuprofen, ketoprofen, metoprolol, naproxen, paracetamol, propranolol, pyrimethamine, thiamphenicol and triclosan in various types of samples with a sensitivity enabling their quantitation at sub-nanogram-per-millilitre levels with good precision (relative standard

deviations less than 7 %) and a high accuracy (near-quantitative recoveries).

Worth special note was the wide variety of samples successfully analysed in this way. Most of the environmental (water, soil, sediment and sludge), food (milk, meat and fish) and biological fluid (blood and urine) samples were found to contain non- steroidal anti-inflammatories/analgesics, antibiotics, hormones and personal care products.